l
l דפוס אלקטרופורזה של קולגן לאחר המלחה.
מיצוי אנזימטי פירושו שלאחר מיצוי קולגן מסיס וקולגן מסיס חומצה, חלק מהפרוטאזות, כגון קולגנאז, פפסין, פפאין וכימוטריפסין, נדרשים לעבור הידרוליזה כדי להשיג קולגנים שונים המסיסים אנזימטית. הפרוטאזות המשמשות מתחלקות בעיקר ל-3 סוגים: פרוטאזות מהחי (כגון טריפסין, פפסין), פרוטאזות מהצומח (כגון פפאין, ברומלין), ופרוטאזות מיקרוביאליות (כגון פרוטאזות אלקליות, פרוטאזות ניטרליות). במחקר על הידרוליזה אנזימטית של קולגן, פרוטאז אלקליין הוא הנפוץ ביותר.
הקולגן מתפרק בצורה מוגבלת, כלומר, הפפטיד הטרמינל מבוקע. מכיוון שהקשרים הקוולנטיים בין שרשראות הפפטיד קולגן נוצרים על ידי אינטראקציה של ליזין או הידרוקסיליזין בפפטיד הטרמינל המולקולרי, הפפטיד הטרמינל מבוקע. את החלק העיקרי המכיל את מבנה הסליל המשולש ניתן להמיס בחומצות אורגניות מדוללות ולחלץ. טיפול באנזים יכול לבצע הידרוליזה של הפפטיד הסופני של קולגן פיברין, לשפר את תפוקת הקולגן; והוא לא יהרוס את מבנה הסליל המשולש של הקולגן וישמור על מאפייניו. ישנם גורמים רבים המשפיעים על מיצוי האנזים, כגון ריכוז האנזים, יחס האנזים למצע, זמן הידרוליזה אנזימטית, טמפרטורת ההידרוליזה האנזימטית, ערך ה-pH ויחס החומר לנוזל. בפעולה בפועל, רוב הקולגן מופק בשיטת תרכובת האנזים, ויותר מופק על ידי פפסין, והחומצה האורגנית היא בעיקר חומצה אצטית.
l אלקטרופרוגרמה של קולגן המופק מפפסין
תהליך ההידרוליזה האנזימטית של קולגן מחולק בעיקר לשיטת הידרוליזה של אנזים בודד ושיטת הידרוליזה רב-אנזמית. שיטת ההידרוליזה הרב אנזימטית מחולקת עוד יותר לשיטת הידרוליזה אנזימטית מעורבת (כגון טריפסין בקר, פרונאזה, bacillus protease מעורב) ושיטת הידרוליזה אנזימטית שלב אחר שלב. בדרך כלל יש לפתח את הבחירה של תהליך ניסוי ותנאים ספציפיים למיצוי אנזימטי של קולגן עור. כדי להשיג פוליפפטידים של קולגן עם משקלים מולקולריים קטנים יותר, משתמשים בדרך כלל בהידרוליזה מולטי-אנזימים. הגורמים העיקריים המשפיעים על השפעת האנזימוליזה הם סוג האנזים, כמות האנזים המווספת, טמפרטורת האנזימוליזה, זמן האנזימוליזה, ערך ה-pH ויחס החומר למים. השימוש במיצוי אנזימטי של קולגן במצטבר יכול לא רק לקצר ביעילות את זמן המיצוי, אלא גם להשיג קולגן בעל פעילות ביולוגית טובה, וגם הזיהום לסביבה קטן. קולגן אינו עובר הידרוליזה בקלות על ידי פרוטאז נפוץ, אך יכול להישבר על ידי קולגנאז של בעלי חיים, ואת השברים השבורים ניתן לבצע הידרוליזה על ידי פרוטאז נפוץ לאחר דנטורציה אוטומטית. התנאים המתאימים לפפסין להסרת קולגן הידרוליזה הם pH 1.65-1.70 וטמפרטורה 37 מעלות.
יש אנשים שמשתמשים בעצמות חזיר כחומרי גלם ומשתמשים בתגובת ההידרוליזה האנזימטית של פרוטאז כדי להחליף את תהליך ייצור הדבק המסורתי ולערוך מחקר ניסיוני על תגובת ההידרוליזה האנזימטית של קולגן ותהליך ייצור הדבק האנזימטי. התוצאות הראו שלפפסין היה שיעור המיצוי הגבוה ביותר של קולגן (46.14 אחוזים), ואחריו טריפסין (43.42 אחוז), פרוטאז ניטרלי (30.14 אחוזים) ופרוטאז אלקליין (21.15 אחוז). הגורמים המשפיעים העיקריים בתגובת ההידרוליזה האנזימטית של פפסין עברו אופטימיזציה על ידי ניסויים של גורם יחיד ואורתוגונלי. תוצאות הבדיקה מראות שהתנאים האופטימליים למיצוי פפסין הם שריכוז הפפסין הוא 1 אחוז, הידרוליזה אנזימטית מתבצעת ב-pH 2.0 למשך 48 שעות, ולאחר מכן מומלחת בתמיסת NaCl בריכוז של 10 אחוז (w/v) ) למשך 24 שעות. שיעור ההחלמה הסופי של הקולגן היה 64.77 אחוזים, ושיעור המיצוי של הקולגן היה 49.75 אחוזים. חלק מהאנשים השתמשו גם בפפסין כדי להפיק קולגן מעור חזיר, ועשו הידרוליזה של ארבעה מינונים שונים של פפסין (1 אחוז, 2 אחוז, 2.5 אחוז, 3 אחוז) דגימה ובדיקה, משוואת HILL מסדר ראשון שימשה כדי לדמות את תהליך מיצוי הפפסין של קולגן עור חזיר ותהליך הריקבון של קצב הידרוליזה של פפסין, ולבסוף התקבל קצב המיצוי של 2 אחוז מינון פפסין ו-6-7שעות זמן הידרוליזה. מַקסִימוּם. יש אנשים שמשתמשים בעור חזיר טרי כחומר גלם, עושים הידרוליזה עם טריפסין בתנאי של 50-52 מעלות, מינון האנזים הוא 5000:1 ~ 10000:1, ערך ה-pH הוא 9, התגובה היא 2-3 h, חומר הגלם: מים הם הידרוליזה אנזימטית בתנאים של 1:2. התוצאות הראו ששיעור המיצוי של החלבון הכולל היה גדול או שווה ל-80 אחוזים.
l קצב התאוששות של קולגן בעור דיונונים על ידי פפסין בטמפרטורה משתנה.
כאשר משתמשים בשיטה האנזימטית למיצוי קולגן, יש לשלוט בקפדנות על תנאי המיצוי:
ראשית, זמן פעולת האנזים חייב להיות מתאים. אם הזמן קצר מדי, הקולגן לא ישוחרר במלואו לתוך התמצית, מה שישפיע על קצב המיצוי; אם זמן פעולת האנזים ארוך מדי, הקולגן יעבור הידרוליזה מוגזמת, וכתוצאה מכך יותר מדי אוליגופפטיד מולקולה קטנה, מה שלא רק יגביר את יעילות ההפרדה והטיהור. הקושי משפיע גם על התכונות התפקודיות והפעילות הביולוגית של הקולגן.
שנית, טמפרטורת ההידרוליזה האנזימטית צריכה להיות מתאימה. אם הטמפרטורה נמוכה מדי, השפעת האנזים אינה ברורה; אם הטמפרטורה גבוהה מדי, זה יגרום לנטרול האנזים ולדנטורציה של הקולגן. לפי דיווחים, כאשר ה-pH של המדיום נמוך מעט מהנייטרלי, טמפרטורת הדנטורציה של הקולגן היא 40-41 מעלות, כאשר ה-pH של המדיום חומצי, טמפרטורת הדנטורציה של הקולגן היא 38-39 מעלות , וטמפרטורת הדנטורציה של קולגן עור דג היא נמוכה ב-7-12 מעלות מטמפרטורת הדנטורציה של קולגן עור חזיר. לכן, אם לקולגן המופק יש פעילות ביולוגית טובה, טמפרטורת המיצוי צריכה להיות נמוכה מטמפרטורת הדנטורציה במהלך תהליך המיצוי.
שלישית, יש לבחור את האנזים המתאים. בדרך כלל, בעת מיצוי קולגן מרקמת יונק יבשתי, סביר להשתמש בפפסין למיצוי בטמפרטורה האופטימלית שלו, אך עבור חיות מים כגון דגים, טמפרטורת הדנטורציה של הקולגן נמוכה מזו של יונקים יבשתיים. לכן, פרוטאזות רבות אינן מתאימים, וכמה תכונות פונקציונליות ופעילויות ביולוגיות של קולגן עלולים להיהרס אם מיצוי בטמפרטורה האופטימלית עבור אנזימים אלה. המחקר על מיצוי הקולגן והפוליפפטידים שלו בשיטות אנזימטיות הוא בעיקר מעורות של בעלי חיים ותוצרי הלוואי שלהם, ויש מעט דיווחים על שימוש בשיטות אנזימטיות למיצוי קולגן ופוליפפטידים שלו מעצמות בעלי חיים.
